Actividad Biológica

Actividad antimicrobiana

Este ensayo tiene como objetivo determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB) de compuestos frente a diversas especies bacterianas y/o levaduras. La CMI se define como la concentración mínima de un compuesto que impide el crecimiento microbiano, manteniendo constante el número de unidades formadoras de colonias (CFU) tras la incubación. La CMB corresponde a la concentración capaz de reducir en un 99,9 % la población inicial.

El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos, lo que permite evaluar múltiples compuestos a distintas concentraciones frente a un microorganismo específico. Los recuentos de viabilidad se realizan en placas de Petri, facilitando además la observación de posibles alteraciones morfológicas de las colonias inducidas por los compuestos.

El SAB dispone de un cepario con bacterias Grampositivas, Gramnegativas y levaduras. La versatilidad del ensayo permite adaptaciones metodológicas, como estudios de sinergia entre compuestos o incluso lo contrario, evaluación de efectos protectores en condiciones de estrés, como alta salinidad, etc.

Curvas de crecimiento

Una vez determinadas la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB) de un compuesto, es posible evaluar su efecto sobre un cultivo bacteriano en el tiempo, mediante curvas de crecimiento durante un periodo de 8 horas. El seguimiento se realiza mediante recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) y medición simultánea de la densidad óptica (DO) del cultivo cada hora.

El ensayo se efectúa utilizando una única concentración del compuesto, habitualmente proporcional a la CMI. En paralelo, se cultiva una muestra control en ausencia del compuesto. Al representar las dos curvas, la diferencia del recuento de viables entre ambas nos permite saber si el compuesto es bacteriostático o bactericida. Por otro lado, una caída pronunciada en la DO respecto al control indica lisis celular.

El ensayo se realiza en matraces de cultivo, y los recuentos de CFU se llevan a cabo en placas de Petri.

Actividad antibiofilm

Bajo condiciones específicas de crecimiento, ciertas especies bacterianas pueden adherirse a superficies y activar genes que codifican proteínas implicadas en la síntesis de señales moleculares que promueven la adhesión célula-célula, iniciando la formación de un biofilm.

En bacterias como Pseudomonas aeruginosa, las moléculas señalizadoras son los compuestos denominados homoserina lactonas, cuya acumulación les confiere un papel como agentes quimiotácticos, atrayendo más células de la misma especie mediante el mecanismo denominado percepción de quorum (quorum sensing), lo que favorece el desarrollo de biofilms.

En condiciones fisiológicas esta estructura permite que otras bacterias e incluso hongos coexistan con Pseudomonas, colonizando tejidos y dispositivos médicos lo cual es un creciente problema de salud pública. El biofilm hace que la bacteria tenga una mayor tolerancia a los antibióticos y mayor resistencia a la defensa del huésped.

La formación de biofilms en cultivos de Pseudomonas puede inducirse en placas de 96 pocillos bajo condiciones de crecimiento específicas. Esta metodología permite evaluar el efecto de compuestos de interés mediante tinción con cristal violeta, seguida de su disolución en etanol para la cuantificación de la biomasa adherida. La absorbancia se mide a 595 nm y se compara con la de un cultivo control no tratado.

Cultivo celular

La búsqueda de compuestos con actividad antitumoral se inicia con la determinación de la concentración inhibitoria media (IC₅₀), definida como la concentración del compuesto capaz de reducir en un 50 % la viabilidad celular. Este parámetro es fundamental para comparar la potencia relativa de diferentes compuestos.

El ensayo, sencillo en diseño, pero dependiente de condiciones estrictas de cultivo, se realiza comúnmente en placas de 96 pocillos. Las células se exponen a distintas concentraciones del compuesto, y tras un periodo de incubación se añade un sustrato que es metabolizado por las células viables, generando un producto coloreado cuya absorbancia se mide espectrofotométricamente. Comparando estos valores con los de los controles no tratados, se calcula la IC₅₀.

Existen múltiples variantes del ensayo: estudios de sinergia mediante combinación de compuestos, cultivos en agar para evaluar la capacidad de formación de colonias, o ensayos en los que ciertas líneas celulares, estimuladas con determinadas moléculas, se diferencian hacia fenotipos específicos.

El formato también puede escalarse a placas de 6 pocillos para evaluar migración celular (modelo de herida), donde se elimina una zona del cultivo mediante raspado y se monitoriza la capacidad de las células tratadas para repoblarla, utilizando microscopía óptica.

El laboratorio del SAB cuenta con un banco de líneas celulares disponible para los usuarios. En caso de requerir una línea específica, el SAB puede encargarse de su mantenimiento, expansión y crioconservación. Este servicio busca facilitar la implementación de técnicas avanzadas de cultivo celular, dentro de las capacidades tecnológicas actuales y con proyección a futuras mejoras en equipamiento.

Expresión génica

El estudio del mecanismo de acción de un compuesto activo requiere evaluar los cambios en la expresión génica inducidos tras su aplicación. Para ello, se aísla el ARN total de células tratadas y se lleva a cabo la retrotranscripción a ADN complementario (cDNA).

El SAB dispone de un sistema de PCR cuantitativa (qPCR), que permite no solo detectar la expresión de genes específicos, sino también cuantificarla con alta sensibilidad y precisión. Esta metodología posibilita analizar el impacto del compuesto sobre el fenotipo celular y discriminar posibles mecanismos de acción, por ejemplo, la inducción de apoptosis en el caso de agentes citotóxicos o antitumorales.

Actividad antioxidante

La identificación de compuestos con actividad antioxidante es de gran relevancia en los sectores farmacéutico y alimentario. Para ello, resulta esencial emplear métodos de cribado estandarizados, sensibles y reproducibles.

El ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) permite cuantificar la capacidad antioxidante de una muestra mediante la comparación con un estándar, el Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E. El ensayo se basa en la inhibición de la oxidación de la sonda fluorescente fluoresceína, cuya intensidad de fluorescencia disminuye progresivamente en presencia de radicales libres. Los compuestos con actividad antioxidante, retrasan esta pérdida de señal, permitiendo evaluar su eficacia.

El SAB emplea un kit comercial validado que permite el análisis por duplicado de hasta 80 muestras en placas de 96 pocillos. A partir de concentraciones conocidas de Trolox y una cantidad fija de fluoresceína, se construye una curva estándar. Las señales de fluorescencia obtenidas de las muestras tratadas se interpolan en dicha curva para determinar su capacidad antioxidante, expresada como micromoles de equivalentes de Trolox por litro (µmol ET/L) o por miligramo de muestra (µmol ET/mg), según el tipo de matriz analizada.

El SAB cuenta con el siguiente equipamiento:

Laboratorio de cultivo celular:

• Centrifuga eppendorf 5810R.
• Incubador de cultivo celular Memmert.
• Incubador de cultivo celular Heal-Force.
• Espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan Sky High.
• Contador de células Denovix Cell Drop FL Fluorescence Cell counter.
• Microscopio invertido para cultivo celular con módulo de fluorescencia Motic + MXH100.
• Cabina de flujo laminar Telstar Bio II Advance.
• Cabina de flujo laminar Aeolus V.
• Cabina de pre-PCR VWR.

Laboratorio de microbiología:

• Cabina de Flujo laminar Telstar Bio II Advance.
• Estufa y refrigeradora VWR Inculine Modelo 100.
• Estufa y refrigeradora VWR inculine Modelo 50.
• Estufa de secado de material P Selecta.
• Lector de absorbancia densitómetro McFarland.
• qPCR Quantum Studio5 Applaied Biosystems.
• Espectrofotómetro para gota Implen NanoPhotometer N60- Touch.
• Microcentrífuga refrigerada Sigma 1-14K.
• Autoclave JP Selecta Presoclave.