Diversidad Genómica

Este servicio dispone de la infraestructura necesaria para implementar las siguientes prestaciones:

1) Preparación, purificación o cuantificación de muestras de DNA y ARN

i) Preparación, purificación o cuantificación de muestras de DNA. La tecnología de purificación de ácidos nucleicos del KingFisher Flex está basada en el uso de esferas magnéticas para la extracción de muestras en un formato de 96 pocillos. Un procesamiento de alta calidad que minimiza el riesgo de arrastre de reactivos y de contaminación cruzada entre las muestras. El procesamiento estándar incluye la extracción de ADN de 94 muestras más 2 controles por run. 
La cuantificación de la concentración de ADN de muestras en placas de 96 pocillos (94 muestras) se realiza con un Infinite® M Nano+. Estas mediciones pueden realizarse mediante detección de fluorescencia (homólogo a Qubit®) o absorbancia (homólogo a Nanodrop®) en las muestras de ADN, según sea requerido.

2) Barcoding, Metabarcoding y Metagenómica

ii) Barcoding de Metazoa. Cuantificación, normalización y amplificación mediante PCR de un fragmento de 658 pb de extremo 3’ del gen COI (fragmento considerado el barcode estándar en Metazoa).

Las cuantificaciones de los extractos de ADN se hacen mediante mediciones de absorbancia en el Infinite® MNano+, que permite trabajar con placas de 96 pocillos. La normalización y la preparación de la PCR se llevará a cabo en su totalidad en la estación Tecan Freedom EVO 150 workstation.

Tras la amplificación positiva de las muestras, la secuenciación Sanger correrá a cargo del cliente, pudiendo enviarse al servicio de secuenciación acordado directamente desde nuestras instalaciones.

iii) Metabarcoding de Metazoa. Se ofrece un servicio automatizado para la elaboración de librerías de metabarcoding para un fragmento del gen COI de 418 pb (extremo 3’ del gen) para su secuenciación de alto rendimiento (plataforma Illumina®). 

El servicio incluye la cuantificación y normalización de la concentración de ADN de las muestras, la amplificación mediante PCR del extremo 3´ (418 pb) del gen COI, y el indexado de las muestras con los índices Nextera XT Index Kit v2, incluyendo los necesarios pasos de limpieza de las muestras en distintos pasos del protocolo mediante esferas magnéticas (AMpure XP). El servicio incluye el chequeo de cada librería XT generada midiendo las concentraciones de rangos de fragmentos en un Bioanalyzer 2100, así como una medición final de la concentración de dsDNA mediante fluorescencia en el lector Infinite® MNano+, y la normalización y pooling final para su secuenciación en la plataforma MiSeq mediante un kit de 2x300 ciclos.

También se ofrece la posibilidad elaborar librerías Nextera XT de fragmentos diferentes al extremo 3´(418pb) del gen COI. Para estos casos el cliente ha de suministrar los productos de PCR, llevando a cabo en nuestras instalaciones el proceso de indexado, normalización, pooling y secuenciación en la plataforma MiSeq. La secuenciación en este caso podrá realizarse con kits de 2x150 o 2x200 ciclos. Los productos de PCR recibidos serán chequeados antes del inicio del proceso para confirmar la calidad de las muestras.

iv) Secuenciación de ADN genómico total. El servicio ofertado consiste en la preparación de librerías TruSeq o TruSeq Nano de Illumina®, y su secuenciación en la plataforma MiSeq de Illumina® (2x300 ciclos o 2x150 ciclos). El servicio incluye la sonicación de las muestras en un sonicador Covaris y la cuantificación de las muestras mediante absorbancia (método homólogo a Qubit) antes y después del proceso de preparación de las librerías. En caso de ser requerido, el servicio incluirá la re-concentración del ADN inicial, o del producto final tras la preparación de las librerías, mediante un kit DNA Clean&Concentrator de Zymo Research. 

Requisitos

1. Preparación, purificación o cuantificación de muestras de DNA: Las muestras a extraer serán entregas al servicio en viales de 1,5 ml (1 muestra por tubo), rotulado con tinta indeleble al alcohol. 
2. Barcoding de Metazoa: En caso de que las extracciones de ADN no hayan sido realizadas por este servicio, los extractos de ADN serán enviados en tubos individuales o en una placa de 96 pocillos, dejando los pocillos 95 y 96 como blanco. 
3. Metabarcoding de Metazoa: Para la elaboración de librerías Nextera XT del extremo 3´ del gen COI se entregará al servicio las muestras en viales individualizados rotulas con tinta indeleble al alcohol. Para la elaboración de librerías Nextera XT distintas a las anteriormente comentadas el cliente ha de suministrar los productos de PCR. Los productos de PCR recibidos serán chequeados antes del inicio del proceso para confirmar la calidad de las muestras.
4. Secuenciación de ADN genómico total: los extractos de ADN serán entregados al servicio en tubos individuales o en una placa de 96 pocillos. Los extractos de ADN recibidos serán chequeados antes del inicio del proceso para confirmar la calidad y concentración de las muestras. 

Se rellenará el fichero Excel proporcionado por este servicio donde se recopilan datos de las muestras para su correcta identificación. 

Al usuario se le facilitará el correo electrónico y el teléfono de contacto del técnico para consultar todas las dudas que le surjan

La cuantificación de la concentración de ADN de muestras se realiza de forma automatizada con un Infinite® MNano+ fluorescence multi-mode microplate reader. Estas mediciones pueden realizarse mediante detección de fluorescencia (homólogo a Qubit®) o absorbancia (homólogo a Nanodrop®) en las muestras de ADN, según sea requerido.

• KingFisher Flex.
• Estación robotizada (Feedom EVO 150 workstation).
• Lector de Absorbancia y Fluorescencia (Infinite® MNano+).
• Agilent Bioanalyzer 2100.